GM-CSF-Maus-Knochenmark-Kulturen …

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GM-CSF-Maus-Knochenmark-Kulturen umfassen eine heterogene Population von CD11c + MHCII + Makrophagen und dendritische Zellen

DCs ergeben sich aus DC-committed Vorläufern und Makrophagen stammen aus Monozyten

DCs und Makrophagen können sowohl unterziehen Reifung bleiben aber trennbare Einheiten

Zusammenfassung

Dendritische Zellen (DCs) sind wichtige Akteure im Immunsystem. Ein großer Teil ihrer Biologie wurde über Kultursysteme, in denen hämatopoetische Vorläufer differenzieren sich in DCs unter der Schirmherrschaft von Zytokinen aufgeklärt. Ein weit verbreitetes Protokoll beinhaltet die Kultur von murinen Knochenmark (BM) -Zellen mit Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (GM-CSF) BM-derived DCs (BMDCs) zu erzeugen. BMDCs ausdrücken CD11c und MHC-Klasse-II (MHC II) Moleküle und mit DCs aus dem Gewebe die Fähigkeit, exogene Antigene präsentieren Zellen isoliert teilen auf T und durch unterziehen Reifung auf mikrobielle Stimuli zu reagieren. Wir zeigen, dass CD11c + MHCII + BMDCs in der Tat sind eine heterogene Gruppe von Zellen, die herkömmliche DCs und Monozyten abgeleiteten Makrophagen umfasst. DCs und Makrophagen in GM-CSF Kulturen durchlaufen sowohl die Reifung nach Stimulation mit Lipopolysaccharid aber reagieren unterschiedlich auf den Reiz und bleiben trennbare Einheiten. Diese Ergebnisse haben wichtige Implikationen für die Interpretation einer Vielzahl von Daten mit DC Kultursystemen erhalten.

Einführung

Dendritische Zellen (DCs) sind Sentinel Leukozyten, die im Gewebe liegen und reagieren Eintrag Erreger durch unterziehen “Reifung” und immer kompetent prime T-Zell-Reaktionen (Banchereau und Steinman, 1998 &# XA0; und&# XA0; Merad et al. 2013). DCs wurden traditionell durch phänotypische und funktionelle Merkmale definiert. Zu den ersteren gehören fehlende Expression von abstammungs beschränkt Marker und die Expression des Integrin CD11c und MHC-Klasse-II (MHC II) Moleküle. Funktionelle Eigenschaften umfassen hohe Beweglichkeit und die Fähigkeit, effizient zu erfassen, zu verarbeiten und Antigene an T-Lymphozyten. Diese Definition ist durch Analysen von späten verschwimmen, die eine deutliche Überdeckungsgrad zwischen DCs und Makrophagen unterstrichen haben, einschließlich der Fähigkeit der letzteren manchmal MHCII und / oder CD11c (Merad et al. 2013) exprimieren. Es hat eine Bewegung veranlasst Mitglieder der mononukleären Phagozyten Familie auf der Grundlage eines anderen Kriteriums, dass der Ontogenese (Guilliams et al. 2014) zu unterscheiden. Dieser Begriff stammt aus neueren Arbeiten zeigen, dass die Differenzierung der DCs unterscheidet sich von der Makrophagen (Guilliams et al. 2014 Hoeffel et al. 2012 Meredith et al. 2012 Satpathy et al. 2012 &# XA0; und&# XA0; Schraml et al. 2013). Tatsächlich entwickeln DCs von einer gemeinsamen DC-Vorstufe (CDP) (Naik et al. 2007 &# XA0; und&# XA0; Onai et al. 2007) über eine Zwischenzellstadium bekannt als pre-DC (Ginhoux et al. 2009 &# XA0; und&# XA0; Liu et al. 2009). Im Gegensatz dazu entwickeln Makrophagen aus embryonalen Vorstufen (Ginhoux et al. 2010 Hoeffel et al. 2012 &# XA0; und&# XA0; Schulz et al. 2012). Zellen, die DCs oder Makrophagen ähneln können auch von Monozyten abgeleitet werden und wurden traditionell von Monozyten abgeleiteten DCs oder Monozyten abgeleiteten Makrophagen, bzw. (Bain et al. 2014 Mildner et al genannt. 2013 &# XA0; und&# XA0; Tamoutounour et al. 2013), obwohl es vor kurzem wurde vorgeschlagen, dass sie von Monozyten abgeleiteten Zellen (MCs) (Guilliams et al generisch bezeichnet werden. 2014). Monozyten selbst wurden von einem gemeinsamen Vorläufer Monozyten (cMoP) (Hettinger et al. 2013), und beide CDPs und cMoPs kann erzeugt werden von einem Makrophagen-DC Vorläufer (MDP) Bevölkerung (Fogg et al. 2006 Hettinger et abzusteigen gezeigt al. 2013 &# XA0; und&# XA0; Liu et al. 2009). So kann man klassische DCs als Zellen definiert, die aus CDPs und pre-DCs unabhängig von Phänotyp oder Funktion abstammen (Guilliams et al. 2014). Wir haben vor kurzem experimentelle Unterstützung für dieses Konzept vorgesehen, durch die Nutzung der Tatsache, dass CDPs und pre-DCs exprimieren DNGR-1 (auch als CLEC9A bekannt). Wir erzielten Clec9a cre Rosa EYFP Reporter Mäusen, in denen die Clec9a Locus-Kontrollregionen fahren Cre-Expression in DNGR-1 + Zellen, für ein Rekombinationsereignis ermöglicht, die irreversibel Spuren CDPs und Pre-DCs Nachkommen (Schraml et al. 2013). Bei diesen Mäusen kann DCs zuverlässig von Makrophagen und MCs von YFP Reporter Genexpression (Schraml et al. 2013) identifiziert und unterschieden werden.

Die Ontogenese Ansatz zur DC-Definition wurde durch die Identifizierung von Kern DC und Makrophagen-Genexpressionssignaturen, die ermöglichen, eine sichere Trennung der beiden Zelltypen (Gautier et al. 2012 ergänzt &# XA0; und&# XA0; Miller et al. 2012). Dies wurde durch systematische Anstrengungen möglich Genexpressionsprofile von Mausgewebe Leukozyten-Populationen, insbesondere durch Immgen Konsortium zu charakterisieren und hat stark die phänotypische Methode der Zellklassifizierung (Heng et al. 2008) erweitert. Globale Beschreibung von Genexpressionsprofilen weiteren ermöglicht die Analyse der Beziehungen zwischen Leukozyten durch unüberwachten hierarchischen Daten Clustering. Diese Methodik hat einen neuen Einblick in die Biologie von Makrophagen, MCs angeboten und DCs. So ergab es, dass DCs aus peripheren Geweben in Lymphknoten Cluster zusammen unabhängig von Ursprungsgewebe migrieren, was darauf hinweist, dass sie ein gemeinsames Programm der Differenzierung (Miller et al. 2012) erlassen. So Ontogenese und globale Genexpressionsanalyse bilden leistungsfähige neue Ansätze, mit denen die Heterogenität der Retikulohistiozytäres System zu sezieren und besser zu definieren, DCs, MCs und Makrophagen.

Wegen ihrer Seltenheit in Geweben, viel von der Biologie von DCs wurde aus Untersuchungen an Zellen gezüchtet in vitro von hämatopoetischen Vorläufern unter dem Einfluss von Wachstumsfaktoren (Caux et al vermutet. 1992. Inaba et al. 1992. Naik et al. 2007 und . Pałuki et al., 1998 &# XA0; und&# XA0; Sallusto und Lanzavecchia, 1994). Insbesondere die Kultur von Maus-BM-Zellen mit GM-CSF, einem Cytokin in der Entwicklung und die Homöostase von mononukleären Phagozyten beteiligt sind, verwendet wurde ausgiebig CD11c + MHCII + Zellen zu erzeugen, die Gewebe DCs ähneln und werden oft BMDCs bezeichnet (Inaba et al . 1992 &# XA0; und&# XA0; Lutz et al. 1999). Die Ausgabe von GM-CSF Kulturen ist heterogen und umfasst Granulozyten und Makrophagen neben DCs. Letztere werden berichtet in der lose anhaftenden Kulturfraktion angereichert werden und CD11c und MHCII auszudrücken, während Makrophagen gedacht werden, für CD11c und MHCII haftend und negativ (Inaba et al. 1992). Als solche verwenden viele Laboratorien üblicherweise magnetisch angereichertes oder FACS-sortierten CD11c + lose adhärenten und nicht-adhärenten Zellen als Quelle von reinem BMDCs. Genexpressionsanalyse Studien solcher Zellen haben angenommen, dass dieser DC-Population homogen ist und dass jede Zelle zu Zelle Variation ist das Ergebnis der verschiedenen Zustände des DC-Reifung (Shalek et al. 2013. Shalek et al. 2014 &# XA0; und&# XA0; Vander Lugt et al. 2014). Jedoch ist die Ontogenese Ursprung BMDCs unsicher und in der Tat Ly6C + Monozyten statt CDPs wurden als Vorstufen (Mayer et al 2014 handeln vorgeschlagen. &# XA0; und&# XA0; Xu et al. 2007). Als solches ist es unklar, wie GM-CSF-derived BMDCs fit im letzten Rahmen von DCs durch ontogenetischer Kriterien zu definieren. Hier zeigen wir, dass CD11c + MHCII + Zellen in BMDC Kulturen in der Tat sind heterogen in Bezug auf hämatopoetischen Ursprungs und Genexpressionsprofilen. Sie umfassen mindestens zwei unterschiedliche Populationen, die aus entweder einer monozytischen oder ein DC myelopoetischen Zweig und daß Anzeige deutliche Immunfunktionen in vitro und in vivo abgeleitet werden. Auf der Grundlage der Ontogenese, morphologischen und Genexpression Kriterien klassifizieren wir diese zwei Populationen als bona fide DCs und Monozyten abgeleiteten Makrophagen. Wir zeigen weiter, daß sie beide Reifung in Reaktion auf Lipopolysaccharid (LPS) unterziehen noch montieren verschiedene Reaktionen auf den Stimulus und bleiben trennbare Einheiten. Diese Ergebnisse haben Auswirkungen für die Interpretation der zahlreichen Studien unter Verwendung von GM-CSF-derived BMDCs als Zellmodell.

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